Fue mandada construir por el Cardenal Cisneros a finales del s. XV sobre el lugar en que, según la tradición, fueron martirizados los Santos Niños Justo y Pastor. El edificio fue diseñado por los hermanos Antón y Enrique Egas en estilo Gótico tardío. Su planta consta de tres naves con bóvedas de crucería, arcos ojivales y girola que comunica las dos naves laterales por detrás del presbiterio. Es, junto a la iglesia de San Pedro en Lovaina (Bélgica), la única Magistral del mundo. Para que el Papa concediese esta categoría, los canónicos de la iglesia debían ser "magíster" (profesores) de la Universidad.
Desafortunadamente, el edificio fue incendiado a comienzos de la Guerra Civil, lo que hizo que desaparecieran las piezas de mayor valor artístico: coro, órgano, trascoro, retablo, tapices. Se conservan, sin embargo, cuatro rejas de gran calidad de Juan Francés: las tres que protegen el presbiterio y la que está situada a los pies del edificio. También cabe destacar el sepulcro plateresco situado en la girola y la portada de la capilla dedicada a la Virgen del Val, patrona de Alcalá. En la capilla situada al lado de la Virgen, se conserva, en una urna de plata dorada, el cuerpo incorrupto del franciscano San Diego de Alcalá -Santo con fama de milagrero que da nombre a la ciudad de California (USA).
En el exterior del templo destaca la imponente torre-campanario, comenzada a construir sobre trazas de Rodrigo Gil de Hontañón a mediados del s. XVI y terminada con estética herreriana un siglo más tarde.